Por Canuto  

Una enzima diseñada mediante evolución dirigida logró eliminar modificaciones de CML en proteínas y tejidos humanos envejecidos, aunque todavía faltan pruebas sobre su seguridad, penetración y capacidad para recuperar funciones biológicas.
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  • CMLase fue creada tras analizar y evolucionar más de 500 millones de variantes enzimáticas.
  • La enzima redujo señales de CML entre 52% y 97% en distintas proteínas, además de disminuirla en piel, arterias y cristalinos humanos.
  • El resultado es una prueba de concepto ex vivo, no una terapia clínica, y aún requiere estudios de funcionalidad, farmacocinética e inmunogenicidad.

CMLase: la enzima diseñada para revertir el envejecimiento químico de las proteínas

Un equipo de investigadores desarrolló una enzima capaz de eliminar una modificación química asociada con el envejecimiento de las proteínas. El trabajo, publicado en Reversión del envejecimiento químico de proteínas por desglucosilación enzimática, presenta una prueba de concepto con posibles implicaciones para la biotecnología y la medicina regenerativa.

La enzima recibió el nombre de CMLase y fue diseñada para actuar sobre la Nε-carboximetil-lisina, conocida como CML. Esta modificación pertenece a los productos finales de glicación avanzada, o AGEs, que se acumulan en proteínas de larga vida.

Los resultados proceden de experimentos in vitro y de muestras de tejidos humanos analizadas fuera del organismo. Por ello, todavía no demuestran que CMLase pueda funcionar como tratamiento contra el envejecimiento o contra enfermedades relacionadas.

Una modificación vinculada con el envejecimiento

La glicación ocurre cuando compuestos derivados de azúcares y lípidos reaccionan de forma no enzimática con aminoácidos de las proteínas. Con el paso del tiempo, esas reacciones pueden generar AGEs estables que alteran la estructura y la función de los tejidos.

La CML destaca entre esos compuestos porque aparece con frecuencia en proteínas de larga duración. Se encuentra en estructuras como la matriz extracelular, el cristalino del ojo, la piel, los riñones y las paredes de los vasos sanguíneos.

Cuando una lisina se convierte en CML, pierde su carga positiva y adquiere un grupo carboximetilo con carga negativa. Ese cambio puede afectar las interacciones entre proteínas y modificar las propiedades de tejidos que dependen de una arquitectura molecular estable.

La acumulación de CML también puede activar el receptor RAGE, asociado con los productos finales de glicación avanzada. Según el estudio, esta señalización puede estimular NF-κB y favorecer la liberación de citoquinas proinflamatorias y factores de crecimiento relacionados con la fibrosis.

Los sistemas naturales de desintoxicación, como la vía de la glioxalasa, eliminan precursores reactivos antes de que formen AGEs. Sin embargo, no suelen revertir los aductos estables que ya se incorporaron a las proteínas durante décadas.

De una enzima promiscua a CMLase

Para desarrollar CMLase, los investigadores buscaron una enzima que pudiera reconocer la similitud química entre la glicina y la parte carboximetil-amino de la CML. El punto de partida fue una glioxalasa de glicina dependiente de FAD.

Una enzima de Bacillus subtilis mostró actividad contra CML libre, pero su eficiencia fue aproximadamente 30 veces menor que frente a su sustrato natural, la glicina. Además, no presentó actividad detectable contra péptidos modificados con CML.

El equipo examinó homólogos de glioxalasa de glicina para identificar estructuras con un acceso más amplio al sitio activo. La búsqueda computacional revisó decenas de miles de secuencias y condujo a una enzima de Calidithermus roseus llamada CrGO.

CrGO sí mostró actividad inicial contra un sustrato peptídico con CML, aunque en niveles reducidos. Su estructura carecía de una hélice cercana al sitio activo, una característica que aparentemente facilitaba el acceso de moléculas más grandes.

Después, los investigadores utilizaron selección genética y evolución dirigida para mejorar la enzima. La campaña evaluó más de 500 millones de variantes y produjo la versión CrGO-897, que fue denominada CMLase.

Selección genética y mejoras de actividad

El sistema de selección utilizó bacterias Escherichia coli auxótrofas para lisina. Las células solo podían crecer cuando una variante activa convertía CML en lisina, lo que permitió identificar rápidamente las enzimas con mejor desempeño.

Para evaluar péptidos, los investigadores diseñaron un mecanismo en el periplasma bacteriano. Una CMLase activa transformaba la modificación en lisina, y una tripsina localizada en el mismo compartimento cortaba el péptido para permitir que los fragmentos llegaran al interior celular.

La primera ronda de evolución produjo CrGO-764, una variante con siete sustituciones de aminoácidos. Esa versión consiguió una mejora de cinco veces en la actividad sobre CML peptídica.

En rondas posteriores, el equipo modificó bucles que obstruían parcialmente la entrada al sitio activo. CrGO-785 incorporó la sustitución H49W y una eliminación de dos aminoácidos, lo que mejoró la afinidad por los péptidos modificados.

Las siguientes rondas ajustaron residuos del sitio activo y buscaron aumentar la estabilidad térmica. Finalmente, CrGO-897 reunió 15 sustituciones de aminoácidos y una eliminación de dos aminoácidos frente a la enzima CrGO original.

Resultados en proteínas completas

Los investigadores probaron CMLase sobre albúmina sérica bovina modificada con CML. Una reacción con 5 µM de enzima y 1 µM de proteína produjo peróxido de hidrógeno a una tasa de 0,90 µM por hora.

Los controles sin CMLase activa no generaron peróxido de hidrógeno detectable. Los análisis mediante electroforesis y western blot mostraron que la albúmina permaneció intacta y que la señal de CML disminuyó de forma dependiente de la enzima.

El equipo también examinó caseína, hemoglobina, colágeno y un extracto proteico total de retina de oveja. La reducción de las señales de CML osciló entre 52% y 97%, dependiendo del sustrato analizado.

La proteómica permitió estudiar con mayor detalle la acción de CMLase sobre la albúmina. De 33 residuos de lisina modificados que fueron detectados, 30 mostraron una disminución de CML después del tratamiento.

Veintiún sitios registraron reducciones superiores al 50%, mientras que siete superaron el 90%. La actividad no dependió únicamente de la exposición superficial, pues algunas lisinas expuestas mostraron respuestas muy distintas.

Pruebas en tejidos humanos envejecidos

El estudio evaluó muestras humanas porque la acumulación de CML requiere largos periodos y resulta difícil reproducirla en animales de vida corta. Los experimentos se enfocaron en cristalino, piel y tejido arterial.

En proteínas del cristalino de un donante de 64 años, CMLase redujo el contenido total de CML en 45% mediante LC-MS/MS. Un ensayo ELISA observó una disminución de 78%, posiblemente porque detectó con mayor facilidad las modificaciones expuestas.

En secciones de tejido arterial envejecido, el tratamiento redujo más de 70% la tinción asociada con CML. La enzima de control, sin actividad catalítica, no produjo una reducción comparable.

En piel humana envejecida, CMLase disminuyó más de 55% la tinción de CML en las capas epidérmica y dérmica. El tratamiento llevó los niveles observados por debajo de los registrados en piel de un donante de 31 años.

Estos datos muestran que la enzima puede actuar sobre proteínas modificadas en distintos contextos estructurales. Sin embargo, las muestras fueron homogeneizadas o correspondieron a secciones fijadas, condiciones que pueden facilitar el acceso al sustrato.

Limitaciones y próximos pasos

El estudio demuestra la reversión química de CML, pero no establece que los tejidos recuperen su biomecánica original. Tampoco confirma que la disminución de CML silencie la señalización patológica de RAGE dentro de un organismo vivo.

Una dificultad importante será lograr que la enzima penetre la matriz extracelular densa e interconectada. Las modificaciones ocultas en regiones profundas podrían permanecer fuera del alcance de CMLase.

La investigación tampoco caracterizó directamente la actividad sobre CML ubicada en los extremos N-terminales de las proteínas. Además, aunque la enzima mostró selectividad frente a carboximetil-arginina, su alcance completo aún necesita más estudios.

El origen bacteriano de CMLase plantea preguntas sobre inmunogenicidad. Si se requirieran dosis repetidas, podrían ser necesarias estrategias de desinmunización o medidas para modular la respuesta del sistema inmunitario.

La reacción produce peróxido de hidrógeno y glioxilato, compuestos presentes de forma natural en los biofluidos. Los autores consideran que la cantidad generada sería pequeña frente a la capacidad metabólica de eliminación, aunque este punto también deberá comprobarse en estudios de seguridad.

Una plataforma más amplia para reparar daño molecular

La relevancia del trabajo no se limita a CMLase. La estrategia de evolución dirigida podría adaptarse para buscar enzimas contra otras modificaciones proteicas vinculadas con la edad y las enfermedades metabólicas.

Entre los objetivos potenciales figura el glucopano, un entrecruzamiento importante de la matriz extracelular humana que contribuye a la pérdida de elasticidad. A diferencia de CML, ese compuesto todavía es resistente a la reversión enzimática conocida.

El trabajo fue realizado por investigadores de Revel Pharmaceuticals, Calico Life Sciences y la Universidad de Colorado. Revel Pharmaceuticals presentó una solicitud de patente relacionada con el estudio y señaló a Narisa Trabosh y Aaron Cravens como inventores.

La investigación recibió apoyo del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento de los Institutos Nacionales de Salud mediante los premios R43AG084351 y R44AG084351. Los autores indicaron que el contenido es responsabilidad exclusiva de los investigadores y no representa necesariamente la posición oficial de los NIH.

La publicación ofrece una prueba de concepto llamativa, pero todavía distante de una aplicación clínica. El principal aporte consiste en mostrar que una modificación considerada irreversible puede convertirse en un objetivo de reparación molecular mediante ingeniería de proteínas.

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